ДААННЫЙ РАЗДЕЛ СОДЕРЖИТ ВАЖНУЮ ИНФОРМАЦИЮ С КОТОРОЙ НЕОБХОДИМО ОЗНАКОМИТЬСЯ ПЕРЕД ОЦЕНКОЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ!

Исследования на основе секвенирование нового поколения или NGS является сложными и для их оценки его результатов требуются специальные знания. Результаты этого исследования могут быть правильно интерпретированы только врачом-генетиком или врачом другой специальности, обладающим соответствующей подготовкой.

В результате исследования могут быть получены от нескольких десятков до нескольких десятков тысяч генетических вариантов (индивидуальных отличий от референсной структуры ДНК ). Как правило эти варианты являются непатогенными, даже, если они встречаются в генах связанных с генетическими заболеваниями. Для оценки вероятности патогенности каждого варианта используются специальные алгоритмы, которые приоритезируют обнаруженные варианты по вероятности их патогенности. В заключении и разделах настоящего файла варианты расположены в порядке снижения вероятности их патогенности.

В заключении по результатам исследования содержится классификация вариантов в соответствии с рекомендациями ACMG. Каждый вариант может быть отнесен к одной из 5 категорий:

• Pathogenic - патогенный
• Likely pathogenic - вероятно патогенный
• Uncertain Significance - с неизвестным клиническим значением
• Likely Benign - вероятно доброкачественный (вероятно непатогенный)
• Benign - доброкачественный (непатогенный)

В то же время формальные критерии не всегда отображают реальное значение обнаруженного варианта для пациента и его связь с имеющимся фенотипом. Даже патогенные, по формальным критериям, варианты могут не быть причиной имеющихся у пациента заболеваний. Кроме того, к результатам NGS применимы не все критерии ACMG. После сегрегационного анализа семьи (обследование родителей, а иногда и других родственников пациента) вариант может быть переклассифицирован.

Важным критерием патогенности варианта является наличие его в базах данных патогенных вариантов. В заключение включены данные о наличии варианта в курируемой БД CLINVAR. Каждый вариант в CLINVAR в большей мере связан с конкретным фенотипом. Варианты, включенные в заключение, в том случае, когда они содержатся в БД CLINVAR могут иметь следующие категории:

• Pathogenic - патогенный
• Likely pathogenic - вероятно патогенный
• Uncertain Significance - с неизвестным клиническим значением
• Likely Benign - вероятно доброкачественный (вероятно непатогенный)
• Benign - доброкачественный (непатогенный)
• Conflicting interpretation of pathogenicity - имеются противоречия в классификации варианта разными специалистами.

**** Practical Guideline - наиболее высокая степень достоверности классификации основанная на мнении наиболее авторитетных специалистов
*** Expert panel - высокая степень достоверности, основанная на мнении нескольких экспертов
** Сriteria provided, multiple submitters, no conflicts - вариант однозначно классифицирован несколькими источниками
* Сriteria provided, single submitter -вариант, как связанный с каким либо заболеванием классифицирован одним источником
No assertion provided - вариант однозначно не описан в связи с каким либо фенотипом

Важным этапом диагностики является сопоставление фенотипа пациента с фенотипом, описанным для заболевания, связанного с геном, в котором обнаружен вариант. В заключение, в раздел "Приоритетные варианты" включаются варианты , имеющие признаки патогенности и находящиеся в гене, связанном с заболеванием, фенотип которого соответствует фенотипу, указанному в направительном диагнозе или медицинских документах. В то же время оценка фенотипа по представленным медицинским данным имеет существенные ограничения. Только непосредственный осмотр пациента, и оценка других лабораторных и инструментальных методов исследования врачом может дать полную клиническую картину которая должна быть сопоставлена с результатами NGS содержащимися в разделе "Варианты с признаками патогенности" настоящего файла.

РЕКОМЕНДАЦИИ (АЛГОРИТМ) ПО ПОИСКУ ПРИЧИНЫ ЗАБОЛЕВАНИЯ СРЕДИ ПРИОРИТЕЗИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ

1.Рекомендуется сопоставление фенотипа пациента с фенотипом заболеваний, ассоциированных с геном.

2.Для выбора алгоритма дальнейшего обследования, необходимо учитывать тип наследования заболевания (AD – аутосомно-доминантный, AR – аутосомно-рецессивный, XLR – X-сцепленный рецессивный, XLD – X-сцепленный доминантный и т.д.), фенотип которого соответствует фенотипу пациента, а также зиготность варианта.

При наличии гетерозиготных вариантов в генах, связанных с синдромами, имеющими аутосомно-доминантный тип наследования:

Ранее описанные в авторитетных источниках патогенные варианты* необходимо подтвердить методом секвенирования по Сэнгеру. При отсутствии симптомов у родителей, их обследование, как правило, не требуется.

Ранее не описанные как патогенные варианты, варианты имеющие единичные описания, вероятно-патогенные варианты и варианты с неизвестным клиническим значением - требуется подтверждение его наличия у пробанда и проведение поиска данного варианта у родителей и методом секвенирования по Сэнгеру. Если такой вариант будет выявлен у одного из родителей, не имеющего признаков заболевания, то такой вариант с высокой вероятностью не имеет самостоятельного клинического значения.

Для гомозиготных и компаунд гетерозиготных вариантов в генах, связанных с синдромами, имеющими аутосомно-рецессивный тип наследования:

Ранее описанные в авторитетных источниках патогенные гомозиготные варианты необходимо подтверждать методом секвенирования по Сэнгеру у пробанда.

При выявлении вероятно компаунд гетерозиготных вариантов (два варианта в одном гене) необходимо проведение секвенирование по Сэнгеру трио (пробанд и родители) для каждого из этих вариантов.

При выявлении вероятно компаунд гетерозиготных вариантов типа SNV/MNV (изменения одного или нескольких нуклеотидов и хромосомная аномалия (CNV) необходимо проведение обследования трио для поиска мутации методом секвенирования по Сэнгеру и для поиска CNV – методом хромосомного микроматричного анализа (ХМА). Для уточнения оптимального вида исследования необходимо обратиться в лабораторию Геномед.

В случае выявления одного гетерозиготного патогенного варианта (носительство) при наличии соответствующего фенотипа рекомендуется углубленный поиск патогенного варианта на втором аллеле. Для этого, в зависимости от частоты встречаемости тех или иных вариантов (CNV, мутации в некодирующих областях) может быть рекомендовано проведение ХМА или секвенирование генома GenomeUNI.

Гемизиготные варианты в генах, связанных с синдромами, имеющими Х-сцепленный рецессивный тип наследования:

Ранее описанные в авторитетных источниках патогенные варианты необходимо подтвердить методом секвенирования по Сэнгеру.

При выявлении вариантов, ранее не описанных как патогенные либо имеющие единичные описания, вероятно-патогенных вариантов и вариантов с неизвестным клиническим значением рекомендуется обследование родственников мужского пола по линии матери.

Варианты в генах, связанных с синдромами, имеющими Х-сцепленный доминантный тип наследования:

Ранее описанные в авторитетных источниках патогенные варианты необходимо подтвердить методом секвенирования по Сэнгеру. При отсутствии симптомов у родителей, их обследование, как правило, не требуется.

При выявлении вариантов, ранее не описанных как патогенные, вариантов имеющих единичные описания, вероятно патогенных вариантов и вариантов с неизвестным клиническим значением, требуется проведение поиска данного варианта у родителей (если мутация обнаружена у девочки) или у матери (если мутация обнаружена у мальчика) и подтверждение его наличия у пробанда методом секвенирования по Сэнгеру.

Вариации числа копий генов (CNV):

Вариации числа копий ДНК (CNV) необходимо подтверждать методом ХМА. Для уточнения оптимального вида исследования необходимо обратиться в лабораторию Геномед.

*К авторитетным источникам можно отнести курируемые базы данных – ClinVar (Варианты со статусом Practical Guideline (****)/Expert panel (***), OMIM и др.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ

Анализ ДНК проводится по технологии секвенирования нового поколения методом парно-концевого чтения. Для таргетных тестов (гены, панели, секвенирование экзома) используется методика селективного захвата участков ДНК, относящихся к кодирующим областям генов включенных в исследование. В некоторых случаях в анализ могут быть включены клинически значимые регионы в некодирующих участках генома. Для полного секвенирование генома используется методика фрагментации ДНК PCR free технологии пробоподготовки для анализа.

Среднее покрытие целевых участков секвенирования в исследуемых генах для таргетных тестов составляет не менее 70х. Это означает, что каждый исследуемый участок генома в среднем анализируется не менее 70 раз для избежания влияния технических ошибок чтения на результаты исследования. Для полного секвенирования генома среднее покрытие по всму геному не менее 30х.Такое покрытие позволяет осуществлять детекцию вариантов, в среднем, не менее чем в 98% целевых участков, входящих в исследование. Для сложных участков генома (например, GC-богатых участков) среднее покрытие может быть ниже. Участки генома с покрытием, не соответствующим критериям достоверности вследствие технических ограничений сиквенса, в дальнейший анализ не включаются.

Метод позволяет выявить наследуемые или вновь возникшие (de novo) варианты нуклеотидной последовательности (однонуклеотидные замены, небольшие инсерции и делеции – до 10 п.о.), которые могут являться причиной генетического заболевания.

Для таргетных тестов (гены, панели, секвенирование экзома) технические ограничения метода не позволяют выявлять инсерции и делеции длиной более 10 п.о., мутации в интронных областях (за исключением канонических сайтов сплайсинга), вариации длины повторов (в том числе экспансии триплетов), а также мутации в генах, у которых в геноме существует близкий по последовательности паралог (псевдоген). Метод не предназначен для определения фазы пар гетерозиготных мутаций, а также для оценки уровня метилирования или выявления мутаций в состоянии мозаицизма.

В некоторых случаях биоинформатический анализ данных позволяет заподозрить наличие структурных перестроек (микроделеций и микродупликаций). Однако этот подход не является рекомендованным методом анализа вариаций числа копий генов, и обнаруженные перестройки подлежат обязательному подтверждению референсным методом (хромосомный микроматричный анализ). Мелкие структурные нарушения, однородительские дисомии и мозаичные варианты числа копий генов методом секвенирования не выявляются; для этого должен быть использован валидированный метод хромосомного микроматричного анализа. Невыявление структурных вариантов при секвенировании не исключает их наличия у пациента.

При проведении полного секвенирвоания генома метод позволяет выявить наследуемые или вновь возникшие (de novo) изменения структуры ДНК которые могут являться причиной генетического заболевания:

-Однонуклеотидные замены в том числе в интронных и межгенных участках.

- Небольшие инсерции и делеции – от 1 нуклеотида

- Делеции и дупликации (CNV) любого размера

- Варианты в митохондриальной ДНК

- Тринуклеотидные повторы (болезни экспансии)

- Сбалансированные транслокации с точным определением координат разрыва.

Обработка данных секвенирования проводится с использованием автоматизированного алгоритма, включающего выравнивание прочтений на референсную последовательность генома человека (hg38), постпроцессинг выравнивания, выявление вариантов и фильтрацию вариантов по качеству, а также аннотацию выявленных вариантов по каноническому транскрипту каждого гена и их приоритезацию с учетом рекомендаций ACMG. Варианты, не соответствующие критериям качества из дальнейшего анализа исключаются.

Автоматизированный алгоритм приоритезирует варианты по вероятности их влияния на функцию белка. Это не означает, что какой-либо из обнаруженных вариантов является причиной заболевания у пациента.

Для оценки значимости варианта необходимо сопоставление найденных вариантов с клинической картиной пациента, а в некоторых случаях дополнительный биоинформатический анализ.

Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов при дальнейшем анализе рекомендуется использовать базу данных OMIM, специализированные базы данных по отдельным заболеваниям (при наличии) и литературные данные

В приоритезированный список включены обнаруженные варианты в кодирующих областях генов, обладающие средним и высоким влиянием на синтез белка (миссенс, нонсенс, сдвиг рамки считывания), а также варианты в сплайсинговых участках генов. Синонимичные варианты (не приводящие к замене аминокислот) и варианты в интронных областях генов, а также варианты с высокой частотой и не описанные ранее как патогенные, не включены в приоритезированный список.

В связи с быстрым обновлением информации о патогенности вариантов и появлением новых данных, в некоторых случаях может быть рекомендован повторный анализ данных секвенирования. Повторный анализ данных секвенирования может быть рекомендован при изменении фенотипа пациента, появлении новых симптомов, связанных с прогрессированием заболевания, либо при появлении новых данных лабораторного и инструментального обследования, изменяющих направления дифференциальной диагностики.